2024-06-26
参加者
開会の挨拶と導入
オリバー・ボール： すでにご参加いただいている皆様、ありがとうございます。開始まであと数分お待ちください。
それでは、時間になりましたので始めさせていただきます。皆様、こんにちは。「Unbridled Excellence」ウェビナーシリーズの第8回へようこそ。本シリーズのホストを務めます、ダークホースで事業開発ディレクターをしておりますオリバー・ボールです。
このウェビナーシリーズは、細胞・遺伝子治療の分野で10年にわたり活動してきたダークホースが培った経験や知見を共有するために企画しました。この10年間で約380社のクライアントを支援しており、その中で得た豊富な経験を、このウェビナーを通じてコミュニティの皆様と分かち合いたいと考えています。
ご存知の方も多いかと思いますが、AAVの特性解析については以前から継続的に取り上げてきました。数年前、高用量AAVの毒性に関するFDAの諮問委員会（AdCom）を受け、当社の細胞・遺伝子治療CMCチームと規制チームがニコール・ペルキー氏と共同執筆した「フル／エンプティ比の特性解析」に関するガイダンス草案を公開しました。
その後、このトピックに関するホワイトペーパーも発行しました。本日はジェイコブがその詳細を解説しますので、私からの説明はこれくらいにしておきます。これは私たちにとって非常に重要なテーマであり、業界全体で特性解析の基準が向上することで、大きな恩恵が得られると考えています。
ジェイコブにバトンタッチする前に、次回のトピックについてお知らせします。来月は「IND（治験薬申請）の作成」をテーマに取り上げます。IND作成プロセスの開始を検討されている方、あるいはすでに着手されている方は、数日中に開始される登録案内をぜひチェックしてください。当社のLinkedInで登録情報を公開します。ダークホースに依頼する以外にも、IND作成プロセスを可能な限り円滑に進めるための非常に有益な内容になるはずです。
登録は数日中に開始されます。また、今回のウェビナーを含め、過去のすべてのウェビナーは当社のウェブサイトでオンデマンド配信されています。内容を復習したい場合や、同僚の方と共有したい場合は、ぜひウェブサイトをご覧ください。
それでは、早速ですがジェイコブに交代します。自己紹介と本日のトピックの解説をお願いします。ジェイク、お願いします。
メインプレゼンテーション：高度なAAV特性解析技術
ジェイコブ・スタッドハマー： ありがとう、オリバー。ご紹介ありがとうございます。また、本日のプレゼンテーションとウェビナーにご参加いただいた皆様にも感謝申し上げます。本日は、AAVのリリースパネルに高度な特性解析技術を導入する際の実際的な検討事項についてお話しします。
改めて自己紹介をさせていただきます。ダークホースでプリンシパルを務めておりますジェイコブ・スタッドハマーです。入社して3年半が経ちました。私の主な専門分野は、AAVおよびレンチウイルスベクターのプロセス開発、プロセスバリデーション、製造、そして分析です。本日はその分析について詳しく掘り下げていきます。繰り返しになりますが、ダークホースには3年半以上在籍しております。
Dark Horseでの在籍中、私は50以上の組織を支援し、プロジェクトに携わってきました。そのため、ここで紹介する内容の多くは、それらのプロジェクトから得た直接的な経験と知見に基づいています。また、以前はVoyager TherapeuticsおよびEncoded Therapeuticsに在籍していました。
本日は、まずこの分野の背景と導入から始め、AAVリリース試験における高度な手法の実装に伴う課題についてお話しします。その後、AAV分析の深掘りとして、特に重要な3つの領域における改善の機会について解説します。1つ目は次世代シーケンシング（NGS）を用いたAAV製品中の核酸分析、2つ目は空カプシド、完全カプシド、および不完全カプシドの特性評価、3つ目はカプシドタンパク質の分析と翻訳後修飾の評価です。
また、高度なAAV分析に関する特定の規制ガイドラインの概要と、これらの手法を導入する際に活用すべき指針についても触れます。最後に、私たちがこれらの高度な手法を実装してきた経験に基づき、結論と推奨事項をまとめます。
画面上にQ&Aボタンがありますので、プレゼンテーション中いつでもお気軽に質問をお送りください。発表中に確認し、すぐに回答できるものはその場で対応します。難しい場合は、最後にまとめて質疑応答の時間を設けます。
AAVリリース試験の背景と導入
まず、AAVリリース試験と高度な特性評価に関する背景と導入から始めます。この分野が注目されている理由の一つに、2021年に開催されたFDAの諮問委員会（AdCom）があります。ここでは、遺伝子治療製品におけるAAVベクターの毒性リスクが議論されました。結論から言うと、高用量のAAV製品で確認されている毒性リスクの原因を特定する決定的な要因は見つかりませんでした。そのため、業界のスポンサー、研究者、規制当局は、なぜこうした毒性問題が発生するのか、さらなる証拠を求めています。
有力な仮説はいくつか存在しますが、なぜ一部の毒性が生じるのかについては、依然として不明な点が多く残されています。このため、分析の世界において、これらの要因をより詳細に特性評価し、毒性だけでなく有効性に関連する要素との相関関係を解明するためのさらなる技術革新が求められています。
さらに、AAV遺伝子治療のスポンサーにとって、必要なリリース試験項目に関するガイダンスは限定的です。多くのスポンサーは、IND（治験薬申請）前やINDの段階で規制当局からのフィードバックを待ち、それから試験方法の判定基準を設定しています。私たちは、スポンサーが自らこれらの試験方法を構築し、提案できるようにするためのより良い枠組みを提供したいと考えています。
また、従来使用されてきた手法の多くには大きな限界があり、製品をより適切に特性評価するために、常に新しい手法が開発されています。ここでは、臨床用および商用製品の両方にこれらの高度な手法を適用する際のベストプラクティス、アドバイス、そして私たちの経験を共有します。
2023年に発行したAAVの不均一性に関するDHCホワイトペーパーについても触れておきたいと思います。これは本日の議論の基礎となるものです。この論文では、AAV製品における不均一性と関連不純物に焦点を当て、これらの特性が製品の全体的な品質プロファイルにどのように寄与するかを解説しています。
不均一性をいくつかのカテゴリーに分類しました。1つはカプセル化されたDNA配列長の不均一性、2つ目はDNA配列同一性の不均一性、3つ目はカプシドタンパク質の完全性、化学量論、および翻訳後修飾（PTM）の不均一性です。この論文へのリンクを記載しましたので、詳細な読み物としてご活用ください。
本日のプレゼンテーションでは、ホワイトペーパーそのものの解説に終始するのではなく、ホワイトペーパーで取り上げた領域に基づき、実際のAAV製品に適用可能な応用例や技術の進歩に焦点を当てます。
現在のAAVリリース試験における課題
現状を整理すると、一般的なAAVリリース試験では、初期の判定基準を設定する際に文献に頼らざるを得ない状況があります。スポンサーがよく引用する文献の一つに、2008年に発表されたWrightらの論文がありますが、AAVリリース試験や分析手法が当時から大きく進歩した現在でも、多くの仕様や手法がそのまま使われています。判定基準の設定に関するガイダンスは多いものの、多くのスポンサーは依然として文献の参照に頼っているのが実情です。
さらに、2020年には遺伝子治療INDのCMC情報に関するFDAの業界向けガイダンスが発行されましたが、ここでも具体的なリリース試験項目や判定基準の推奨事項はかなり限定的です。
それに加え、高度な手法をAAVリリース試験に組み込むことは非常に困難です。その理由は、再現性の確保や既存手法に対する優位性の証明といった技術的な課題に加え、血清型や導入遺伝子ごとの違いがあるためです。血清型や製品が異なれば手法にも課題が生じるため、すべての製品に同じ手法を適用できるとは限りません。
アッセイに使用する材料や消耗品の管理も非常に困難です。これについては後ほど詳しく説明しますが、非常に複雑なアッセイであるためです。さらに、規制上の考慮事項、機器のコンプライアンス、バリデーション、21 CFRへの準拠なども重要です。アッセイのバリデーションにおいて、どのような標準品を使用するか、どのような対照群で直線性を示すかといった点は、開発の初期段階から検討すべき非常に難しい課題です。
また、プログラムに関連する課題もあります。高度なアッセイは開発に時間とコストがかかり、プログラムのタイムラインを長期化させる可能性があります。スポンサーは最短で臨床試験に進みたいと考えるのが一般的です。すでに既存の手法でINDが承認されているプログラムの場合、手法を変更することは、ブリッジング試験やINDの変更申請が必要となるため非常に困難であり、スポンサーが必ずしも選択する道ではありません。
深掘り1：AAV分析のための次世代シーケンシング
先ほど挙げた3つの主要領域について、詳しく解説します。まずはAAV製品の配列組成と同一性の分析から始めます。これは主に次世代シーケンシング（NGS）によって行われます。次に、空カプシド、完全カプシド、不完全カプシドの深掘りとして、完全・空・不完全カプシドの割合、および目的の遺伝子より短い、あるいは長い（過剰パッケージングされた）カプシドの評価について説明します。最後に、カプシドタンパク質の分析として、一次アミノ酸配列、化学量論、翻訳後修飾について触れます。それぞれの手法、実装のための推奨事項、そしてリリース試験にこれらの手法を導入した私たちの経験を具体的に共有します。
次世代シーケンシング（NGS）から始めましょう。まず、この技術が活用できる最初の領域は、導入遺伝子の同一性および組成の解析です。通常、AAV製品の同一性試験にはサンガーシーケンシングが用いられます。これは実績があり、操作が容易で、バリデーションも確立されているため、広く利用されてきました。しかし、この手法では通常、リファレンス配列やアライメント用マップと比較して単一のコンセンサス配列が報告されるだけです。そのため、マイナーな製品バリアントは検出されません。つまり、リード全体の50%未満しか含まれていないような成分は拾い上げられず、コンセンサス配列のみが報告されてしまうのです。
また、GC含量が高い領域や反復配列、特にAAV製品におけるITR（逆位末端反復配列）のシーケンシングには困難が伴う場合があります。これが、実際に使用する上で多くの課題や問題を引き起こす可能性があります。次世代シーケンシング法は、同一性および組成解析においてサンガーシーケンシングの優れた代替手段となります。次世代シーケンシングの分野にはいくつかの異なる技術があり、詳細な説明は割愛しますが、何を測定し、どのように値を報告したいかに応じて、ショートリードシーケンシングとロングリードシーケンシングという選択肢があります。
同一性や組成の解析に加え、次世代シーケンシングでは残留DNAの解析も可能です。現在のFDAガイダンスでは、残留DNAは1用量あたり10ナノグラム未満、かつ約200塩基対以下に抑えることが推奨されています。しかし、既存の方法でこれを正確に測定することは極めて困難です。またFDAは、E1AやSV40といった懸念される配列について、各細胞株や製品に応じてスポンサーが制限値を設定することも求めています。
しかし、AAV製品において1用量あたり10ナノグラムという基準を達成することの難しさは、業界全体で広く認識されています。そのため、スポンサーは製品に含まれるDNA量が多いことの正当性を検討する必要があり、多くの場合、インビトロおよびインビボ試験とリスク評価を組み合わせて対応しています。しかし、これらの試験は変動が大きく、次世代シーケンシング以外の方法では得られない詳細な情報なしにリスク評価を行うことは非常に困難です。
さらに、現在の手法の一部では、特定の標的配列に対してqPCRやddPCRベースのアッセイが使用されています。しかし、これらの手法で探索対象としていないものは測定できません。このように、現在の手法には次世代シーケンシングで解決可能な多くの限界があります。繰り返しになりますが、すべての残留DNAが同等の安全上のリスクを持つわけではありません。FDAガイドラインにある「1用量あたり10ナノグラム」という基準は、すべての種類の残留DNAに当てはまるとは限りません。現在、リスクの高いDNAと比較的リスクの低いDNAを理解するための進歩がこの分野で進んでいます。次世代シーケンシングを用いれば、存在する特定の配列を特定し、そのリスクを定量的に把握することが可能です。
リリース試験で一般的に使用される市販キット（残留293 DNAや残留Sf9/バキュロウイルスDNAなど）では、前述の通り全体像を把握することはできません。測定・管理が必要な他の配列が存在する場合、一般的な市販キットではすべてのDNAを測定できない可能性があります。そのため、次世代シーケンシングのような非特異的な手法を用いることで、存在するすべてのDNAを把握できるようになります。懸念される特定の配列を定量化・調査できるため、より精度の高いリスク評価が可能となり、製品に含まれる残留DNAのプロファイル全体を真に理解できるようになります。
AAVの特性解析における次世代シーケンシングの活用について、最も優れた用途の一つはカプシド内DNAの解析であり、これにより部分ゲノムの定量が可能になります。導入遺伝子に大きな欠失がある場合や、不純物配列がパッケージングされている場合、その長さや量を定量化し、正確な内容を把握することができます。
全長導入遺伝子の変異を調べることも可能です。ITRバリアント、ITR内の微小欠失、点変異、メチル化パターンなどを確認することで、導入遺伝子の組成と完全性を深く理解できます。また、過剰パッケージングされた配列の解析も可能です。例えば、導入遺伝子と不純物配列が組み合わさったキメラリード（組換えによって発生する可能性があるもの）を解析することで、適切な配列がパッケージングされているか、導入遺伝子が正しい長さ、サイズ、完全性を保っているかを確認することが重要です。
さらに、後ほど詳しく説明しますが、同一性試験としても利用でき、パッケージングされた配列の特性解析や、導入遺伝子とのアライメントを行うことで、導入遺伝子の完全性を保証できます。出力結果として、切断や変異の解析、配列長・完全性の全体的なプロファイル、期待される配列とのアライメントなどが得られます。これにより、導入遺伝子が期待通りに100%一致しているのか、あるいは欠失や変異を持つマイナーな集団が存在するのかを、定量的な観点から把握することが可能になります。
AAV解析のためのNGS手法の開発と標準化は困難を伴う場合があります。しかし、私たちが経験してきた実用的な考慮事項を共有し、開発・導入を目指す方々への推奨事項としてお伝えしたいと思います。NGSアッセイの目的は、手法、コントロール、バリデーション戦略に影響を与えます。同一性試験、不純物の定量、不純物の制限値設定、あるいは含有量の測定のどれを目的とするかによって、アッセイバリデーションの要件（ICHガイダンスに関連するもの）が異なります。手法の目標に応じて、バリデーションとコントロールの要件が変わることを理解しておく必要があります。
また、全く同じ機器や一般的な手順、ライブラリ調製法を使用していても、バイオインフォマティクスパイプラインが異なれば（例えば、ウイルス安全性試験と切断解析の違いなど）、それは全く別のアッセイとみなされる点に注意してください。たとえ機器や準備方法が同じであっても、これらは別々に管理する必要があります。繰り返しになりますが、アッセイバリデーション戦略は異なり、コントロールも異なる可能性があります。
アッセイ開発の手順についてです。Illuminaプラットフォームのようなショートリードシーケンシングを目指すのか、それともPacBioやNanoporeのようなロングリードシーケンシングを目指すのか。これらはすべてアッセイの目的に左右されます。異なる切断や大きな断片の欠失を確認したい場合はロングリードシーケンシングが適しており、特定の配列のレベルや差異を実際に定量化したい場合はショートリードシーケンシングの方が適していることが多いです。これは、スパイクイン、ネガティブコントロール、リファレンススタンダードといったアッセイコントロールにも影響します。また、データテーブル、グラフ、報告値といったアッセイの出力結果も、使用するアッセイの種類によって異なります。
次に、バイオインフォマティクス戦略とデータインテグリティについてです。これらはすべて21 CFR Part 11に準拠する必要があります。品質管理システム（QMS）内に、データ解析のための特定のパイプラインを構築しなければなりません。オペレーターの判断に委ねるようなバイオインフォマティクスパイプラインは避けるべきです。明確に定義され、バージョン管理されており、変更が生じた場合は必ずQMSを通す必要があります。
合格基準の設定は、使用するアッセイの種類と目的によって異なります。同一性試験なのか、不純物の定量なのかによって、アッセイ出力の形式や値の報告方法が決まります。重要なのは、科学的根拠、過去のデータ、製造経験に基づいて合格基準を正当化することです。その合格基準が何を意味するのかを正確に理解しないまま、基準を設定するような事態は避けなければなりません。
最後に、Dark Horseでは、製品特性を評価するために可能な限り早い段階でNGSを活用することを強く推奨しています。これは、プロセス変更のサポート、リスク評価、アッセイ開発において非常に有用です。臨床開発が進み、後期開発、そして最終的な商業化へと移行するにつれて、この重要性はますます高まっていきます。
一方で、AAV解析におけるNGSアッセイには明確な課題もあります。アッセイの適格性評価やバリデーションの戦略は必ずしも標準化されていません。多くのスポンサーがそれぞれ少しずつ異なる手法を用いており、各アッセイやシステム内であっても、戦略を個別に検討する必要があるでしょう。
ライブラリ調製法、コンピュータシステム、試験ラボ（特に外部委託する場合）は、GMPやバリデーションを念頭に置いて構築されていないことがよくあります。そのため、スポンサーがCROと手法を確立していても、後期段階になってその試験ラボが必要なバリデーション戦略をサポートできないことに気づくケースが多々あります。これは非常に困難な状況を招くため、最初から最終的なゴールを見据えて取り組むべきです。
一部のシステムではリード長のバイアスにより定量化が困難になることがあります。前述の通り、目的によってショートリードかロングリードかを検討する必要があります。リファレンススタンダードの確保も課題です。類似製品のリファレンススタンダードが利用できないことも多く、自社内のリファレンススタンダードに頼らざるを得ません。また、データ解析に関する業界標準も確立されておらず、多種多様なバイオインフォマティクスパイプラインが存在します。最終的には、何を基準とするかをスポンサー自身が定義しなければなりません。
最後に、これらのアッセイは、特にCROに外部委託する場合、費用が高額になることがあり、ターンアラウンドタイム（納期）も非常に長くなる傾向があります。
ディープダイブ2：空カプシド、フルカプシド、および部分カプシドの解析
次に、空カプシド、完全カプシド、および部分カプシドの分析について解説します。空カプシドと完全カプシドの比率は、AAVの特性評価において最も重要な要素の一つです。空カプシドや部分カプシドは、抗原負荷全体に寄与し、製品の安全性や有効性に影響を与える可能性があります。これはFDAの諮問委員会（AdCom）でも強調されており、FDAのガイダンスでも具体的な推奨事項が示されているため、確実に定量化する必要があります。すべてのAAV製品において、IND（治験薬新薬申請）を開始する前に制限値を設定しておくべきです。
業界全体で空カプシドと完全カプシドの比率分析の必要性は認識されていますが、その具体的な数値や、部分カプシドや過剰パッケージングされたカプシドの仕様をどのように設定すべきかについては、まだ統一された見解が得られていません。Dark Horse社は、この分野にはさらなるガイダンスが必要であると考え、2022年に空カプシドと完全カプシドの比率に関する具体的な推奨事項を盛り込んだドラフトガイダンスを提出しました。それ以降、空カプシドの許容限界を標準化しようとする動きが多くのグループで見られます。
空カプシドと完全カプシドの比率を分析するための一般的な手法をいくつか紹介します。詳細な説明は省きますが、主要な手法に焦点を当てます。現在、最も標準的（ゴールドスタンダード）とされているのは、分析用超遠心分離法（AUC）です。これは圧倒的に広く利用されている手法ですが、他にもクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）やクライオ透過型電子顕微鏡（cryo-TEM）などがあり、これらもますます普及し、利用頻度が高まっています。
手法によって、部分カプシドやパッケージングされた配列の違いを検出できる能力には差があります。繰り返しになりますが、常に最終的な目的を念頭に置いてください。部分カプシドを把握する必要があるのか、あるいは自社の製品が部分カプシドを生じやすい懸念があるのか。分析手法を選択する際には、こうした点をすべて考慮する必要があります。
私たちの経験に基づき、空カプシド、完全カプシド、および部分カプシドの分析に関する推奨事項を共有します。前述の通り、スポンサーは臨床開発の全期間を通じて、空カプシド、部分カプシド、およびペイロードを含まないすべてのカプシドを定量化し、制限値を設定しなければなりません。もはや空カプシドと完全カプシドを定量化するだけでは不十分です。部分カプシドについても理解を深め、制限値を設定する必要があります。
これらの制限値は、生体内で使用され、安全性と有効性が確認されたロットに基づいて設定されるべきです。つまり、前臨床および臨床開発を通じて定義する必要があり、そのためには特定の分析手法の実施が求められます。
空カプシドと完全カプシドのみを評価していると、製品関連不純物の重要なサブセットを見落とす可能性があります。そのため、空カプシド、完全カプシド、部分カプシドのすべてを分析し、さらにパッケージングされた配列の同一性分析と組み合わせることを推奨します。部分カプシドが存在する場合、そのカプシドの内容物や発生源を特定し、どのように制御・最小化できるかを真に理解することが重要です。
繰り返しになりますが、臨床候補品を選択する段階で、関連するすべての品質特性を考慮して開発を進められるよう、IND申請に向けた試験を開始する前の可能な限り早い段階でこれを行うことを推奨します。臨床開発の途中でこれらの分析を始めるのは適切ではありません。最初からしっかりと理解しておくことで、プロセスを制御し、部分カプシドの発生を最小限に抑えることが可能になるからです。
詳細解説3：カプシドタンパク質および翻訳後修飾の分析
最後に、カプシドタンパク質および翻訳後修飾（PTM）の分析について詳しく解説します。これはAAV分野において比較的新しく、明確な定義がなされ始めた領域です。AAVカプシドは約60個のタンパク質構造で構成されているため、VP1、VP2、VP3の比率は、監視および制御において極めて重要な検討事項となります。この比率は、製造方法、ロット間のばらつき、分解、保管条件などに影響を受ける可能性があります。
AAVの血清型が異なると、わずか数個のアミノ酸の違いしかない場合もあります。そのため、VP配列のわずかな違いが、製品の性能、安全性、有効性に大きな差をもたらす可能性があります。
現在、多くの手法には限界があります。一部のリリース試験パネルでは、VPタンパク質比率の同定や定量化に、ウェスタンブロットやキャピラリー電気泳動（CE-SDS）のみに頼っているケースがあります。こうした手法では、自社製品に対して特異的でない可能性があり、懸念が生じることがあります。
さらに、アセチル化、脱アミノ化、糖鎖付加といった翻訳後修飾（PTM）が特定のアミノ酸残基で発生することがあります。これも血清型、製造方法、保管条件などに大きく依存します。PTMが安全性や有効性に与える影響については現在十分に解明されていませんが、業界内では議論の的となっており、スポンサーは臨床開発を進める上で、少なくとも分析、検討、監視を行うべき項目です。
前述したように、ウェスタンブロットなどの現行手法には課題があります。ウェスタンブロット用の抗体は複数のカプシド血清型に結合する可能性があり、自社製品に対して特異的ではない場合があります。また、ウェスタンブロットやSDSゲル上のVPバンドのデンシトメトリー解析は精度が低く、サンプル間で直線性や再現性を確保することが困難です。さらに、これらの手法ではPTMによる違いを定量化することもできません。
この種の分析には、LC-MSやLC-MS/MS（タンデム質量分析）といった高度な手法が利用可能です。また、ネイティブ質量分析も有効です。これらを用いることで、一次アミノ酸配列を特定して同一性を確認できるだけでなく、カプシドに生じている翻訳後修飾を定量・分析し、製造プロセスや保管条件に起因する変化を把握することができます。
スポンサーは臨床開発を進めるにあたり、製造施設内の他の製品と確実に区別できる十分な感度を持つ手法を用いて、カプシドの同一性試験を行う必要があります。これは、共有の製造施設を使用しており、施設内で製造される他の製品と区別できるほど感度の高い試験法がない場合に特に懸念されます。質量分析は、特定のカプシドを同定し、他の製品と区別するのに十分な感度を備えた優れた手法です。
結論として、VP化学量論の定量には、SDSゲルを用いたデンシトメトリー解析ではなく、CE-SDSのような定量的な手法を用いるべきです。また、臨床開発およびプロセス開発を進める中で、翻訳後修飾の特性評価を行うことを強く推奨します。どのPTMが安全性や有効性にどのような影響を与えるかは、現時点では業界全体でも十分に解明されていません。しかし、可能な限り測定し、理解しておくべき項目です。この種の分析が成熟するにつれ、特定のPTMの影響度や、監視の必要性に関する業界全体の知見も深まっていくはずです。
次に、これらの高度な分析手法に関する規制ガイドラインについて、実装する上で特に重要と思われるものをいくつか紹介します。ICH Q2では、測定する製品特性の種類に基づいたバリデーション要件が記述されています。前述の通り、手法の種類によって要件は異なります。例えば、次世代シーケンシング（NGS）を同一性試験としてのみ使用する場合、求められるのは特異性ですが、不純物の定量に使用する場合は、作業範囲、正確性、精度も必要となります。
繰り返しになりますが、常に最終目的を念頭に置いてください。同一性試験として開発するなら特異性の検証を考え、定量的な不純物試験として開発するなら、最初から作業範囲、正確性、精度などを考慮する必要があります。
ICH Q5A R2には、ウイルス安全性評価における次世代シーケンシング（NGS）試験に関する具体的な要件が盛り込まれました。このガイドラインには、既存のウイルス検出試験を補完または代替するためにNGSを使用する場合の要件が含まれています。また、これらの試験において慎重な検討が必要な重要なステップとして、サンプルの前処理、核酸の濃縮、核酸抽出、ライブラリー調製、シーケンシングプラットフォームの選択（ショートリードかロングリードかなど）が挙げられています。さらに、バイオインフォマティクス手法やその要件についても触れられており、ウイルス安全性評価に使用する場合のバリデーション要件も記述されています。
次に、ICH P14で分析手順の開発に関する検討事項について説明します。ここで特に強調したいのが「分析ターゲットプロファイル（ATP）」という特定の領域です。これは、多くの方に馴染みのある「品質ターゲット製品プロファイル（QTPP）」と似た概念ですが、分析手順の開発における基盤となるものです。次世代シーケンシングプラットフォームやバイオインフォマティクス手法の選定、バリデーション手順の策定などに非常に有用であり、臨床開発を進める中で継続的に監視・更新していくべきものです。
結論と推奨事項
最後に、本プレゼンテーションのまとめと推奨事項を強調しておきたいと思います。繰り返しになりますが、常に「最終的なゴール」を見据えて早期から取り組んでください。アッセイを開発する際は、バリデーションへの道筋が明確なサービスプロバイダーを利用しましょう。臨床開発の初期段階でバリデーション不可能なアッセイを採用したり、バリデーションや適切な管理体制の構築に大きな課題を抱えるCRO（医薬品開発受託機関）を選定してしまったりするスポンサーを何度も見てきました。後になってから問題に気づくことのないよう、最初からその点を考慮に入れておくことが重要です。
スポンサーは、継続的な改善を目指し、リリース試験や特性解析において最低限の基準を超えることを目標とすべきです。最低限のリリース試験パネルと、臨床開発、プロセスバリデーション、そして商業化を成功に導くための試験パネルとでは、その役割が異なります。リリースパネルや特性解析手法を改善しておくことは、根本原因の調査やプロセスバリデーション試験、プロセス特性解析などを進める上で非常に大きな助けとなります。
さらに、AAV分野では特性解析、規格設定、プロセス改善、製品理解のためにNGS（次世代シーケンシング）ベースのアッセイが広く採用されつつあります。そのため、スポンサーの皆様には、プロセスおよび製品開発の初期段階からこれらの手法を導入することを強く推奨します。
すべての臨床用AAV製品において、部分充填カプシドの同定と定量を行う必要があります。空カプシドと完全カプシドだけでなく、それらの中間体についても、その内容を特定し、どのように制御すべきかを理解しなければなりません。部分充填カプシドが生じにくく、完全カプシドを効率的に生成できる堅牢な臨床用製品を選定するためにも、早期からの評価を強く推奨します。
翻訳後修飾（PTM）の解析は、現時点では多くのスポンサーに広く普及しているわけではありませんが、製品およびプロセス開発において開発する価値のある有用なアッセイだと考えています。これは、プロセス開発の評価や変更、プロセス特性解析、プロセスバリデーション手法の構築を強力にサポートします。また、今後、特定のPTMが製品に与える影響の大小が明らかになるなど、新たな知見が得られる可能性もあります。
アッセイの開発、適格性評価、バリデーションは複雑な手法ほど困難を伴う場合がありますが、こうした高度な手法は製品開発の効率を向上させ、AAV製品の安全性と有効性を高めることにつながります。最終的な目標は、この分野を発展させ、より安全で効果的な製品を開発することであり、それによって、より多くの患者さんや疾患、適応症に対して治療を届けることが可能になります。
以上となります。貴重なお時間をいただきありがとうございました。ご質問があれば、さらに詳しくお話しさせていただきます。
質疑応答
Oliver Ball: ジェイコブさん、ありがとうございました。非常に包括的で詳細な内容でした。質問しようと思ったことが、次のスライドで次々と回答されていて、素晴らしいプレゼンでした。一つお聞きしたいのは、こうした手法に対するFDAの視点についてです。これらの手法を用いることによる規制上の影響やメリットは何でしょうか？また、より詳細な特性解析を行うことで、かえって自分たちの作業を増やしてしまうリスクはないのでしょうか？この点についてのお考えをお聞かせいただければ幸いです。
Jacob Staudhammer: オリバーさん、素晴らしいご質問です。結論から言えば、対象によって異なります。部分充填カプシドや空・完全カプシドの解析などは、今や具体的な要件となりつつあります。現時点で、空、完全、部分のすべてを定量するよう求められないケースは考えにくいでしょう。
一方で、PTM解析のようなものについては、現時点では当局が初期段階からのモニタリングを必須とする明確な姿勢を示しているとは言えません。製品に関する多くの情報を得られる優れた特性解析手法であることは間違いありませんが、IND（治験薬申請）に含めるべきだというコンセンサスは、まだこの分野で形成されていないと考えています。
次世代シーケンシング（NGS）解析については、そのアッセイの目的次第です。もし既存のウイルス安全性評価の代替として用いるのであれば、なぜその手法が既存の手法と同等以上であるかを証明する必要があります。製品特性解析の様々な側面でNGSを活用する場合も、その用途によって判断が分かれるでしょう。しかし、これまでのところ、当局が高度な特性解析のためにNGSを使用することに対して異議を唱えたことは一度もありません。
Oliver Ball: ありがとうございます。もう一つだけ、よくある課題や失敗についてお聞きしたいです。こうした手法を導入しようとする際に、開発や適格性評価を効率的かつ効果的に進めるために、どのような点に注意すべきでしょうか？
Jacob Staudhammer: 非常に重要なご質問です。私たちが直面する主な課題の一つは、スポンサーが初期段階で手法を開発・実装した際、後期段階に入ってその手法をバリデーションしようとすると、特定の基準を満たせなくなるという点です。例えば、そのアッセイで求められる中間精度に達しないといったケースですが、これは初期開発の段階であれば容易に対処可能です。しかし、スポンサーにとって、バリデーション可能なレベルまでアッセイを開発するために初期段階で時間と費用を投じることはハードルが高く、結果として、後からアッセイを再開発してバリデーション可能な水準まで引き上げるために、当初よりも多くの時間とコストを費やすことになってしまいます。
閉会の辞
オリバー・ボール： 素晴らしいですね。ありがとうございます。それでは、本日はこのあたりで終了とさせていただきます。締めくくる前に改めてお伝えしますが、本シリーズの次回のウェビナーは来月、IND（治験薬申請）の作成に関するテーマで開催予定です。登録については、当社のLinkedInページをご確認ください。また、今回のウェビナーおよび過去のすべてのウェビナーは、当社ウェブサイトからご覧いただけます。興味深いコンテンツを多数掲載しておりますので、ぜひチェックしてみてください。本日はご参加いただき誠にありがとうございました。また次回お会いできることを楽しみにしております。
ジェイコブ・スタッドハマー： ありがとうございました。